沉默突变：攻克癌症的方向？

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在科学探索的道路上，往往需要打破长期存在的观念，才能创造新的理论。

撰文 | XZ
我们知道，基因突变有可能引发癌症。DNA 片段中某个碱基对的突变会改变基因所编码的氨基酸序列——这类突变往往被判定为引发疾病的主要因素，被称为“非同义突变”，也是癌症研究的主攻方向。
与此对应的，还有一种“沉默”的突变，又被称为“同义突变”或“中性突变”，这种突变并不改变所编码的氨基酸种类。
同义突变不影响蛋白质的氨基酸序列，所以一直被认为是无害的。它们“沉默”，是因为它们“没什么用”，只能说是一种奇怪的生物现象。长期以来，同义突变从未获得癌症研究的重视。
但情况正在改变，转折终将发生。
沉默基因的突变或许也在引发疾病越来越多的研究表明，同义突变并非“无害”，它还是可能会导致疾病。几年前，美国圣母大学的癌症生物学家路昕就意识到了这一点。
有一天，路昕接待了一位希佩尔-林道综合征（Von Hippel–Lindau disease，VHL综合征）患者，为其做病情分析。VHL综合征是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，是由位于染色体3P25.3的VHL抑癌基因（Von Hippel–Lindau tumor suppressor gene）发生突变而引起的。功能性的VHL蛋白在细胞增殖以及血管调节中具有重要作用，当VHL抑癌基因突变时，细胞无法表达功能性的VHL蛋白，就会表现为多器官肿瘤综合征。通俗地说，全身各处都可能长肿瘤。
VHL基因为常染色体显性遗传，因此只有当染色体上的两个VHL等位基因（指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因）全都发生突变时，细胞才无法表达VHL蛋白，导致肿瘤形成。
在交谈中，路昕了解到这位患者的两个女儿也遗传了VHL综合征。这两个七岁双胞胎女孩的视网膜长出了无法切除的肿瘤。然而，查看了三人的基因组测序数据后，路昕惊讶地发现，这三人的VHL基因中并没有发生改变蛋白质的突变，而是仅存在一个同义突变，即序列CCA突变成了序列CCG。这两个序列编码的氨基酸相同（都是脯氨酸），从理论上讲，这样的突变不会产生任何生物效应，应该不会引发疾病，可是三人的的确确都患有VHL综合征！
路昕非常困惑。为了弄清是怎么回事，他为这一家人采集了皮肤样本，从中分离出细胞系，进行一系列分析^[1]。他发现，VHL抑癌基因中的同义突变影响了mRNA剪接的过程。所谓mRNA剪接，是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程（详见《基因测序20年后，终于搞清了垃圾DNA是干啥的》）。在这一过程中，同义突变破坏了剪接蛋白与特定核苷酸序列的结合，导致一段mRNA被剪切掉了，产生了“简化版”的mRNA。所以，这三名患者在特定组织中均没有完整的VHL蛋白，才出现了VHL综合征的症状。
事实上，越来越多的证据表明，同义突变并不总是无害的，路昕的发现只是冰山一角。在生命的演化过程中，来自外界的压力会改变演化的方向，在这样的选择性压力下，通常会出现同义突变。同义突变可以以多种方式来影响基因表达，并与囊性纤维化、自闭症以及癌症等疾病有关^[2]。尽管如此，由于目前还没有对同义突变的系统分析，每当讨论癌症的话题时，同义突变带来的影响基本上都会被研究人员所忽略，非同义突变才是讨论的“核心”。
目前，一些科学家正在扭转研究者们对待同义突变的轻视态度。据估计，DNA中的某些同义突变可能占所有致癌突变的5%-8%^[3]。这些科学家正努力通过系统研究来破译这些突变对癌症的影响，并了解它们对整个基因组的影响程度，这样的研究不仅可以确定部分患者的疾病驱动机制，还可能开辟新的治疗途径。
同义突变如何制造“噪音”？同义密码子的核苷酸序列不同，而编码的氨基酸相同，所以才称之为“同义”。但是，路昕等人的研究表明，事情并不是“同义互换”那么简单——同义密码子间并不是完全可以互换的。实际上，特定序列的密码子可以影响基因表达调节蛋白（如转录因子）与DNA调控位点的结合，还可以影响剪接蛋白与mRNA前体的相互作用。例如，有的mRNA前体本来是表达抑癌基因的，但一些同义突变破坏了它的剪接，结果促进了肿瘤生长^[4]。
同义突变也可能改变非同义突变带来的影响，即，通过影响mRNA的剪接来促进非同义突变基因的表达^[5]。例如，研究人员利用基因编辑技术将各种突变设计到人类癌细胞系中，发现由于碱基种类发生了改变，原来的剪接位点被破坏了，非同义突变产生一个新的剪接位点，有效地从mRNA中去除了部分突变蛋白的编码序列，使得突变蛋白无法完整表达，但是同义突变却可以破坏非同义突变产生的剪接位点，最终又导致突变蛋白完整表达^[6]。也就是说，有些非同义突变需要和某些同义突变一起发生，才能共同表达突变蛋白。这样奇怪的设置，令科学家们惊讶不解。
不同的同义密码子也影响着mRNA的二维结构，从而影响到mRNA在细胞质中的存活时间及其与核糖体的结合。例如，编码人类多巴胺受体D2基因中的同义突变，会使mRNA折叠成不太稳定的构象，导致翻译成蛋白质的mRNA不足量^[7]。
密码子还影响着mRNA的翻译效率。不同的物种，甚至生物体内不同的组织和基因，都会优先使用某些同义密码子来编码特定的氨基酸，以优化其特定的翻译机制。一个很少使用的同义密码子，往往比一个常用的密码子需要更长的时间来翻译，因为在翻译过程中，相应的转运RNA（tRNA）数量较少。在人类细胞中，已经观察到同义突变通过用罕见的密码子替换常用的密码子来减慢翻译速度，或者通过将罕见的密码子转换为常见的密码子来加速翻译，从而最终改变蛋白质的结构或浓度^{[8, 9]}。

至此，同义突变对基因表达的影响可总结为以下几点：

1、改变调节蛋白与DNA的结合位点；

2、破坏剪接位点；

3、影响mRNA的稳定性；

4、影响mRNA的翻译。
更深层次的追寻过去，大多数对癌症有影响的同义突变都是偶然被发现的，对其缺少系统分析，直到2019年的一项研究才取得了一些进展。在这项研究中，科研人员分析了一个包含近300万个突变的数据库，这些突变来自88种肿瘤的1.8万多个组织样本。以此为基础，他们新建了一个包含65万多个同义突变的数据库。数据表明，与非同义突变一样，同义突变也倾向于聚集在与癌症相关的基因中^[10]。
基于这一结论，研究小组选择了大名鼎鼎的KRAS致癌基因，找出其中的同义突变，继续做进一步详细研究。他们一个接一个地用质粒（详见《啥是质粒？从生物武器到转基因食物都跟它有关》）在人类细胞系中表达了突变基因。正如预期的那样，一些同义突变会导致KRAS蛋白水平上升，也就是增加了生物体的患癌风险。
前文提到，同义突变可能会影响mRNA的折叠方式，从而影响基因的表达。为了验证这个猜想，研究小组检测了mRNA与含核苷酸溶液的化学相互作用，通过这个方法来确定mRNA的实际结构，结果发现，同义突变确实会影响mRNA的折叠。这是第一个证明同义突变可以改变癌症基因mRNA结构的证据^[11]。
不过，这项研究还称不上完美。因为实验引入的质粒是已经拼接好的遗传物质，不足以评估突变对剪接的影响，如果能够系统地将同义突变引入细胞的核基因组，取得的数据就会更具有说服力；当然，这对技术也提出了更大的挑战。
与此同时，另一些科学家也在寻找新的方法，以预测同义突变对基因表达——主要是蛋白质翻译——的影响。以色列特拉维夫大学的计算与合成生物学家 Tamir Tuller就在建立计算模型，预测同义突变对蛋白质翻译起始的影响以及对翻译速度的影响。
瑞典隆德大学的分子遗传学家Helena Persson则将常用密码子突变成罕见密码子的频率作为新的指标，来反映同义突变对蛋白质翻译的影响，因为频率变化可以反映出翻译速度。Persson的团队在雌激素受体（一种与乳腺癌有关的转录因子）中引入某种同义突变，将常见密码子转化为罕见密码子，他们发现，蛋白质的翻译速度随之降低了，而翻译速度又是蛋白质正确折叠的关键，这就导致蛋白质可能无法正确折叠。然而，奇怪的是，这种现象只有多种同义突变共同发生时才会产生影响，这表明不同的同义突变之间可能存在某种联系。这种联系可能有助于解释，为什么一些具有特定突变的患者对针对他们设计的药物没有反应。
总的来说，研究同义突变如何相互作用，不仅是了解肿瘤产生的关键，也是了解肿瘤敏感性和耐药性的关键。目前，Persson团队正在进行同义突变组合的研究，来解释这种联系。
与“肿瘤治疗”的距离研究同义突变，除了加深人们对癌症的理解外，或许也能给病人带来一些福音。例如可以借助它来完善像乳腺癌这样家族性癌症的筛查^[12]。目前大约5 - 10%的乳腺癌病例是遗传性的，但科学家们只发现了其中一小部分的致病突变，其它的致病突变或许能够在同义突变中得到答案。未来我们或许可以将这些突变纳入癌症筛查范围，从而完善癌症筛查指标。
此外，在开发更通用的癌症诊断和预后工具方面，同义突变研究也具有一定作用。在2021年的一项研究中^[13]，研究人员通过使用人类癌症样本中发现的同义突变数据集来训练机器学习算法，以预测癌症类型以及患者在初步诊断后10年存活的可能性。当他们在一个新的数据子集上测试算法时，发现这些算法的准确性与仅针对非同义突变进行训练的算法一样好。同义突变的这种预测能力并不一定指向疾病驱动效应，但它可以简单地反映出癌症基因组中的突变情况。这为科学家提供了充分的理由，可以将同义突变作为生物标志物纳入用于肿瘤分类和确定适当治疗方法的工具。
对于癌症的种种研究，最终都是要奔着治疗去的，而同义突变导致的癌症似乎比非同义突变导致的癌症更难治疗。大多数针对非同义突变引发的癌症的疗法都是为了抑制由突变基因产生的致病性蛋白质而设计的，而大多数同义突变却可能压根不会影响最终蛋白质的结构。但话又说回来，即使同义突变不影响蛋白质结构，而是对基因表达的其它过程有影响，也可以用对非同义突变的相同治疗方法来解决。比如那些导致mRNA结构改变的突变，可以使用一种反义寡核苷酸（反义寡核苷酸与靶标基因的RNA结合后可通过各种不同的机制影响靶标基因的表达）来阻断同义突变带来的影响。目前，反义寡核苷酸已被批准用于治疗部分疾病，如纠正导致杜氏肌营养不良的缺陷基因剪接^[14]。
近几十年来，癌症基因组学在非同义突变中的机制研究以及治疗取得了重大进展，但对同义突变的研究才刚刚起步。而最近几年，不断有新的证据表明它们对癌症有影响；虽然以前同义突变一直被忽略，但现在科学家应该重新拾起对同义突变的关注，或许能开辟一条新的研究路线，造福人类。

参考文献

[1] Liu, F., Calhoun, B., Alam, M.S. et al. Case report: a synonymous VHL mutation (c.414A > G, p.Pro138Pro) causes pathogenic familial hemangioblastoma through dysregulated splicing. BMC Med Genet 21, 42 (2020). https://doi.org/10.1186/s12881-020-0976-7

[2] https://www.spectrumnews.org/news/synonymous-mosaic-mutations-may-autism-risk/[3] https://www.cell.com/cell/pdfExtended/S0092-8674(14)00145-7[4] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3746936/[5] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30321177/[6] https://www.science.org/doi/10.1126/scisignal.abp8972[7] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12554675/[8] https://www.science.org/doi/10.1126/science.1135308?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed[9] https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0163272[10] https://www.nature.com/articles/s41467-019-10489-2[11] https://www.nature.com/articles/nprot.2006.249[12] https://www.createhealth.lth.se/canfaster/finished-canfaster-projects/functional-analysis-of-silent-mutations-in-familiar-breast-cancer/[13] https://www.nature.com/articles/s41525-021-00229-1[14] https://practicalneurology.com/news/fda-approves-antisense-oligonucleotide-therapy-for-duchenne-muscular-dystrophy-subtype

本文受科普中国·星空计划项目扶持

出品：中国科协科普部

监制：中国科学技术出版社有限公司、北京中科星河文化传媒有限公司

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